Undersøkelser på sykehus i Tyskland viser at 25-åringen har et delvis avrevet leddbånd i ankelen.
Det tyske fotballforbundet bekrefter lørdag formiddag at Reus derfor ikke kan være med til VM i Brasil.
– Dette er svært beklagelig. Han har vært i storform og hadde spilt godt i kampene mot Kamerun og Armenia. Han ville vært en viktig spiller for oss i VM, sier landslagssjef Joachim Löw.
Superstjernen pådro seg ankelskaden da Tyskland slo Armenia 6-1 fredag kveld - bare seks dager før VM starter. Reus måtte støttes av banen og klarte ikke gå på den venstre ankelen da han skadet seg like før pause.
Helt siden da har det sett dårlig ut med tanke på å rekke VM for 25-åringen.
– Diagnose på Reus: Delvis avrevet leddbånd i ankelen. Ytterligere avgjørelser vil komme separat, skrev Tysklands pressetalsmann, Jens Grittner, på Twitter natt til lørdag.
Reus har en glimrende sesong i Borussia Dortmund bak seg og er blant Tysklands viktigste spillere.
Tråkket over upresset
Borussia Dortmund-stjernen tråkket over helt upresset under fredagens kamp. TV-bildene viste at han trolig fikk en vridning i ankelen.
Kampen var Tysklands siste før VM starter førstkommende torsdag.
– Jeg vet ikke hvor ille det er. Han vil bli undersøkt på sykehus nå og vi må vente og se hva som kommer ut av det. Mye går gjennom hodet ditt i et slik øyeblikk, hvor du bare håper at det har gått bra. Han hadde en ordentlig hevelse, sa Tysklands landslagssjef Joachim Löw om Reus' skade etter kampen.
– Veldig bittert
Heller ikke landslagskaptein Philip Lahm likte situasjonen lagkameraten havnet i.
– Marco (Reus) har vært i fantastisk form og en seriøs skade vil være veldig bittert, sa kaptein Lahm.
Sampdoria-spilleren Shkodran Mustafi tas inn i VM-troppen i stedet for Reus.
Tyskland skal åpne fotball-VM i Brasil mot Portugal 16. juni. Ghana og USA er de øvrige lagene i den VM-gruppen.