Russiske medier rapporterer at om lag ni tusen av underskriftene som Boris Nadezjdin hadde samlet inn, ble erklært ugyldige av valgkommisjonen.
Opposisjonskandidaten hadde levert inn om lag 105.000 underskrifter, og minst 100.000 måtte være gyldige.
– Jeg er ikke enig i avgjørelsen til valgkommisjonen, sier Nadezjdin på sin egen nettside.
Han hevder at han har samlet inn mer enn 200.000 underskrifter over hele Russland.
60-åringen understreker at innsamlingen har foregått helt åpent, og at folk har stått i kø for å vise at de støtter ham.
– Å delta i presidentvalget har vært den viktigste politiske avgjørelsen i mitt liv, sier Nadezjdin.
Han legger til at han ikke vil gi opp ennå, og at han vil anke avgjørelsen til russisk høyesterett.
– Dere avviser ikke bare meg, men titalls millioner mennesker som håper på forandringer, sier opposisjonskandidaten.
Overraskende kandidat
Nadezjdin har markert seg som en krass kritiker av president Vladimir Putin og krever blant annet at Russland stanser krigføringen i Ukraina.
Tidligere har han sagt at det var en «fatal feil» av Putin å angripe nabolandet.
60-åringen vil også bedre Russlands forhold til Vesten og har gitt sin støtte til homofile i Russland.
Nadezjdin stiller som kandidat for det lille partiet Borgerinitiativet. Siden partiet ikke er representert i det russiske parlamentet Dumaen, trengte 60-åringen 100.000 underskrifter nasjonalt og 2500 i en rekke av regionene.
De siste ukene har mange russere i flere byer stått i lange køer for å gi sin støtte til 60-åringen.
Analytikere sier at selv om det er usannsynlig at han kunne slå Putin, så har køene for å støtte Nadezjdin vært et sjeldent tegn på protest og optimisme i Russland.
Kreml viser til regler
President Putins talsperson sier at alle regler har blitt fulgt i valgkommisjonens avgjørelse om å stanse Nadezjdin i forsøket på å stille til valg.
Dmitrij Peskov hevder at det var feil i underskriftene som opposisjonskandidaten leverte inn.
Nadezjdin ba om tre dager ekstra for å bevise at feilene var ubetydelige, men han fikk bare en dag.
60-åringen sier at han vil anke valgkommisjonens avgjørelse i det russiske rettssystemet.
Tidligere sa Putins talsperson at lederne i landet «ikke så på Nadezjdin som en konkurrent».
I Russland har det pågått en diskusjon om Nadezjdin var plukket ut av lederne i Kreml for å gi presidentvalget i mars en illusjon av konkurranse og demokrati.
Men nå som han er nektet å delta, vil mange russere trolig mene at han er en selvstendig opposisjonspolitiker, slik han har påstått hele tiden.