Fangeleiren skal stengjast i løpet av året.
Den nye amerikanske presidenten underskreiv lova i Det ovale rommet i Det kvite hus, med ei gruppe pensjonerte offiserar rundt seg.
Underskrivinga fann stad etter eit møte der internering og fengsling av terrormistenkte vart diskutert.
Stengjer CIA-Fengsel
Obama har også gitt ordre om at alle CIA sine interneringsleirar for terrormistenkte i utlandet skal stengjast.
I ordren heiter det at CIA snarast mogleg skal steje alle fengsel som er i drift i dag, og at etterretningsorganisasjonen heller ikkje skal ha slike fengsel i framtida, opplyser ein ikkje namngitt tenestemann til AFP.
Dermed markerer Barack Obama alt på andre dagen av presientperioden sin eit brot med den utanrikspolitiske lina til forgjengaren George W. Bush.
Guantanamo-leiren har vorte eit symbol på mishandling av fangar og internering utan dom under George W. Bush sitt styre.
- Bodskapen vi sender til verda er at USA framleis skal vere aktiv i kampen mot vald og terrorisme, og at den kampen blir ført med full styrke, men med metodar som er i tråd med verdiane våre, sa Obama då han underteikna lova.
250 fangar
Det er 250 terrormistenkte i fangeleiren i Guantanamo Bay i dag. Det er klart at rundt 80 av dei kjem til å bli stilde for retten med ein terror-tiltalte. 50 blir truleg sette fri, men det kan bli vanskeleg å sende dei tilbake til heimlanda, fordi dei kan bli utsette for tortur.
Truleg vil USA be tredjeland om å ta mot dei.
Fangeleiren i Guantanamo Bay vart oppretta etter terrorangrepa mot USA 11. september 2001 i samband med krigen mot terror.
Ordren om å stengje fangeleiren på Guantanmo er eitt av tre dekret som Obama vil underteikne om behandling av krigsfangar. Han vil også gi fangar rett til å prøve om vedtaket om internering er i tråd med den amerikanske grunnlova.
Grundig saksbehandling
Alle sakene skal vurderast av justis-, forsvars- og utanriksministeren, samt ministeren for nasjonal tryggleik, den nasjonale etterretningsdirektøren og forsvarssjefen.
Ei utgreiing skal avgjerne om dei internerte skal utleverast, setjast fri eller stillast for ein amerikansk domstol.
Forsvarsministeren skal i løpet av 30 dagar undersøkje soningsforholda ved Guantanamo-leiren, og kva som kan gjerast for å gjere dei meir humane.
Forsvarsministeren skal sørgje for at alle militære rettssaker blir stansa i 30 dagar.