Bankens president Ettore Gotti Tedeschi og en annen direktør er anklaget for å ha brutt loven som krever åpenhet rundt bankens finansoperasjoner, melder nyhetsbyrået ANSA.
Pengene ble beslaglagt fra Vatikanbankens konto i en annen bank, Credito Artigiano.
Ifølge nyhetsbyrået AFP mener etterforskere at kontoen kan ha blitt brukt til å skjule svindel og skattefusk.
Vatikanet sier de er «forvirret og forbløffet» over beskyldningene.
– Den hellige stol vil uttrykke maksimal tillit til presidenten og direktøren, heter det i uttalelsen.
Skulle bidra til åpenhet
Tedeschi kom fra jobben som representant for den spanske banken Santander, og ble ansatt i 2009. Ansettelsen skulle bidra til større åpenhet i Vatikanbanken.
Vatikanbanken, som har det offisielle navnet Instituttet for religiøse verk (IOR), administrerer flere bankkonti for religiøse grupper og katolske organisasjoner.
Banken var sist involvert i en større skandale i 1982, da bankgiganten Banco Ambrosiano slo seg konkurs, skriver nyhetsbyrået Reuters.
IOR var Banco Ambrosianos største aksjeholder, og ble beskyldt for å hvitvaske penger gjennom banken.
