Stosur slo Williams med settsifrene 6-2, 6-7 (2/7), 8-6, og møter dermed serbiske Jelena Jankovic i morgendagens semifinale.
Den fjerdeseedede serberen slo Jaroslava Sjvedova fra Kasakhstan 7-5, 6-4 i onsdagens kvartfinale.
Dermed er flere favoritter ute av årets French Open.
Prellet av
Fra før har Stosur slått Justine Henin, Amelie Mauresmo, Lindsay Davenport, Dinara Safina, Ana Ivanovic og Jelena Jankovic. I semifinalen mot lillesøster Williams slo hun til med seier 6-2, 6-7, 8-6.
Williams' varemerke med rå kraft prellet av Samantha Stosur, som straffet verdenseneren med harde og presise vinnerslag.
Fikk nerver
Australieren var på vei mot to strake sett på stillingen 5-2, men fikk nerver og slapp Serena Williams inn igjen i kampen. Også i fjor var Stosur i semifinalen i Paris.
Williams vant sin 12. Grand Slam-tittel da hun vant Australian Open i januar, men må nå følge mesterskapet i Frankrike som tilskuer.