EU innførte avgiften fra nyttår, men en rekke land, blant dem USA, Russland, India og Kina, er imot bestemmelsen og sier den bryter med folkeretten og utgjør en ulovlig handelshindring.
Nyhetsbyrået Xinhua meldte mandag at den kinesiske regjeringen har gjort det klart at landets flyselskaper ikke har lov å betale avgiften, og heller ikke har lov å øke sine priser på billetter eller frakt for å betale avgiften uten statlig tillatelse.
EU innførte avgiften som ledd i innsatsen for redusere utslipp av drivhusgasser etter at det ble klart at det ikke ville komme en global avtale om CO2-reduksjoner.
Avgiften siktet først og fremst mot energiselskaper og industri, men EU bestemte også å inkludere internasjonal flytrafikk som står for 3 prosent av verdens CO2-utslipp.
Flyselskaper som ikke betaler avgiften, kan bli ilagt bøter og i siste instans bli nektet retten til å fly til EUs 27 medlemsland.
Opptrappingen av konflikten skjer bare en uke før et toppmøte mellom EU og Kina.
EU mener på sin side at utspillet fra kinesiske myndigheter ikke får noe å si for CO2-avgiften.
– EU er sikker på at kinesiske flyselskaper kommer til å følge reglene som pålegger dem å betale for CO2-utslipp, sier Isaac Valero-Ladron, som er talsmann for klimatiltakene i EU.